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      新型冠狀病毒核酸檢測過程中靈敏度損失的定量分析

      2022-03-21 00:00:00

      新型冠狀病毒是迄今為止發現的第七種感染人體的冠狀病毒,屬于單股正鏈RNA病毒,其基因組大小為27~31kb。之前發現的6種冠狀病毒中,229E、OC43、NL63以及HKU可引起輕微呼吸道疾病,SARS冠狀病毒和MERS冠狀病毒則能夠引起嚴重呼吸道疾病。根據血清學和基因組特點,冠狀病毒可分為α,β,γ,δ四個屬,此次分離得到的新型冠狀病毒屬于β型。根據當前新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)的規定,疑似病例同時具備以下病原學或血清學證據(實時熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸陽性、病毒基因測序與已知新型冠狀病毒高度同源、血清新型冠狀病毒特異性IgM和IgG抗體陽性、血清新型冠狀病毒特異性抗體IgG抗體由陰性轉為陽性或恢復期較急性期4倍及以上升高)之一,即可確診為新型冠狀病毒肺炎患者??紤]到全球各地的復雜情況,新型冠狀病毒短期內得到完全控制的可能性很小,這就對檢測技術的靈敏度、檢測流程的合理性以及一次性病毒采樣管內檢測試劑質量的可靠性提出了較高的要求。

      由于病毒基因組測序對技術、設備、操作人員的要求較高,特異性抗體檢測具有較長窗口期,而核酸擴增的方法具有窗口期短、檢測靈敏度高的優點,因此通過實時熒光PCR檢測新型冠狀病毒成為各大醫院的選擇。然而根據全國新型冠狀病毒核酸檢測室間質量評價結果報告,樣本號2020002(即陽性參考品濃度為640copies/mL時),實時熒光PCR檢測的符合率僅有84.9%,同時復檢率高達30.7%,轉錄介導的恒溫擴增方法符合率僅有60%,復檢率高達40%,說明現有核酸檢測方法存在弊端,在樣品濃度偏低時,假陰性現象非常明顯。臨床數據顯示,新冠病毒潛伏期大約為14d,個別患者甚至達到29d,病毒在潛伏期時數量增長及臨床癥狀不明顯。這部分新冠病毒感染者的發病周期長,前期病毒載量少,不易于檢測確診,但其感染性卻未降低,目前的檢測方法對于這部分病毒載量較低感染者的篩查非常容易漏檢。

      新型冠狀病毒核酸檢測整個流程分為樣本采集、樣本處理、上機檢測3個步驟,越是靠前的步驟,對于檢測結果的影響也越大,尤其是對陽性臨界樣本。關于樣本采集,各個醫院和專家已達成共識:普通棉簽拭子的核酸檢出率明顯低于帶病毒保存液的植絨拭子,下呼吸道標本檢出率高于上呼吸道標本檢出率。不同樣本類型新型冠狀病毒核酸檢出率從高到低排序依次為:支氣管肺泡灌洗液>抽吸痰或咳痰>鼻咽拭子口咽拭子鼻拭子。大部分廠家和機構都充分考慮了樣本檢測的環節,但是在樣本處理環節卻少有考慮。

      目前磁珠法作為臨床檢測的主流方法,優點是易于實現全自動提取,在節約人力和時間方面具有優勢,缺點是難以處理大體積的樣本。離心柱法的核酸提取效果優于磁珠法,在檢測靈敏度方面具有優勢而且利于較大限度地利用樣本,但缺點是不利于自動化處理,所以綜合兩種方法的優勢,開發全自動的柱提取法將對醫院大批量的樣本檢測帶來幫助??紤]到自動化的重要性,用真空法過柱可能是一個有潛力的發展方向。保存液的pH會影響樣本核酸的掛柱效果,本研究發現,隨著保存液pH的降低,檢測所得的Ct值也降低,表明低pH更有利于假病毒樣本的核酸提取。在保存液的利用方面,本研究分別取2005L和3mL保存液提取核酸,Ct值相差3.68,根據Ct值與反應體系中模板量的線性關系可得知,這相當于檢測靈敏度相差10倍以上,表明可在實際檢測中盡可能充分地利用樣本保存液,有利于減少假陰性現象的出現。

      值得注意的是,當病毒采樣管內保存液體積分別為1,2,3mL時,最終檢測所得的Ct值差異無統計學意義,表明不同體積的保存液中假病毒的濃度幾乎相同。這一結果也說明,不同體積保存液洗脫病毒的效率差異很大,當保存液體積變小時,從拭子上洗脫的假病毒總量也減少,導致洗脫下來的假病毒濃度基本保持不變。因此在實際檢驗中,過少的保存液體積并不能帶來更高濃度的病毒溶液,應當適當增大保存液的體積,這有利于拭子上的病毒樣本充分釋放。為了探究最合適的保存液體積,本研究用添加到拭子上和直接添加兩種方式,分別將相同數量假病毒分別添加到保存液中,發現保存液體積采用IrL.2rL時,兩種方式的Ct值分別相差1.38.0.59,表明拭子上的假病毒樣本并沒有完全釋放到保存液中,并且隨著保存液體積增大,假病毒也釋放得更充分;當保存液體積達到3mL時,兩種方式的Ct值相差0.11,假病毒接近完全洗脫,因此3mL是一個比較理想的保存液體積。

      本研究采用離心柱法進行樣本的RNA提取,使用無核酸酶的水洗脫,這樣所純化的RNA較純掙,抑制成分較少。隨著反應體系中RNA模板的量增大,Ct值相應減小。檢測臨床樣本時,在盡量去除PCR抑制成分的前提下,增加PCR體系中的模板量有利于提高檢測靈敏度。

      基于以上研究,本研究提出了最優的檢測方案:在正確取樣的前提下,使用偏酸性的樣本保存液,并采用理想的保存液體積,將盡量多的保存液采用柱法提取核酸,最后將較大限度的核酸加入PCH體系。將最優檢測方案和目前常規操作進行對比,發現兩種方案的檢測靈敏度相差10倍。因此采用本研究的最優方案可以較大限度地提高實際檢測靈敏度,減少核酸檢測的假陰性現象。


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